生殖器皰疹是由單純皰疹病毒Ⅰ型、Ⅱ型所致性病之一。近年來發(fā)病率明顯升高。單純皰疹病毒可引起皮膚、粘膜及多種器官感染。它可以通過性接觸感染而發(fā)生生殖器官皰疹。
      目前生殖器皰疹的流行情況在STD中非常引人注意，它已成為歐美最常見的性病之一。如英國自1971年的4000例增至19８5年的20000例。在美國，1966-1984年已增加了15倍。估計(jì)美國人群累計(jì)病例超過3000萬。本病占STD中第5位（7.7%）。在歐美國家中占5%-10%，特別是最近由于性行為多樣化，口腔性行為的普遍，生殖器從口腔感染HSV相對增多。另外還有一個(gè)背景，即對HSV無免疫，故成人感染增加。HSV-2是生殖器皰疹的主要病原體，90%生殖器皰疹病例是由HSV-2型引起，10%由HSV-1型引起。世界各地HSV-2型患病率顯著增加，臨床所見的生殖器皰疹患者中，年齡最小者16歲（女），最大者為69歲（男），無論男或女均以20-30歲年齡組，發(fā)病率最高，其比率分別是38%（男）和52%（女）。在美國大學(xué)生中，HSV-2血清流行率僅2%-4%，而家庭診所就診者則高達(dá)25%~30%。在美國總?cè)丝谥薪?0年HSV-2血清流行率增加了1/3，達(dá)23%。在發(fā)展中國家，HSV-2血清流行率更高，如烏干達(dá)婦女保健診所高達(dá)41%，秘魯STD中心為83%。在我國近幾年生殖器皰疹也明顯增加。但發(fā)病率沒有詳細(xì)統(tǒng)計(jì)。
      人群中HSV感染較為普遍，人是皰疹病毒的自然宿主。主要傳染源是生殖器皰疹患者和無癥狀的病毒攜帶者。追查男性的傳染源，近半數(shù)歸咎于嫖妓，其他幾乎來自各種類型的不潔性行為的性濫者。生殖器皰疹患者是在與性伴的性接觸中感染上本病的，而這些性伴通常不知道自己已患上了生殖器皰疹。這就是生殖器皰疹廣泛蔓延的原因之一。
      HSV-1常由飛沫和唾液傳播，而HSV-2幾乎都是性接觸傳播
      HSV感染的診斷要依據(jù)病史、臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果而定。有不潔性交史，而且在生殖器部位出現(xiàn)皮膚紅斑和原發(fā)性水皰，易復(fù)發(fā)等不難診斷。必要時(shí)可作皰液涂片，培養(yǎng)、接種、免疫熒光檢查。血清免疫抗體測定等，均有助于診斷和確定病毒類型。
      一、細(xì)胞學(xué)方法
      對皮損刮片做Wright-Gemsa（Tzanck試驗(yàn)）或Papanicolaou染色，可檢出HSV感染特征的巨細(xì)胞包函體，但不能區(qū)別HSV感染或水痘-帶狀皰疹病毒感染，敏感性僅為病毒分離的60%。
      二、培養(yǎng)法
      從水皰底部取材做組織培養(yǎng)分離病毒，為目前較敏感、最特異的檢查方法，需5-10天，因其技術(shù)條件要求高，價(jià)格昂貴，不能普遍使用。
      三、抗體檢測
      目前最廣泛的是HSV-2抗體檢測，如蛋白印跡法也可用gD2作抗原檢測HSV-2抗體，具有敏感性，且能區(qū)分HSV-1和HSV-2的優(yōu)點(diǎn)。
      四、基因診斷
      （一）用PCR分型檢測單純皰疹病毒
      PCR是一種敏感性高，特異性強(qiáng)的快速檢測方法，標(biāo)本中含有1fgHSV-DNA就可以檢出，其在HSV感染的診斷研究中發(fā)展較快，且分型檢測HSV是發(fā)展的趨勢。
      1、標(biāo)本采集和處理
      （1）標(biāo)本采集
      ①腦脊液：直接無菌采取患者0.5ml腦脊液標(biāo)本于無菌試管送檢.如肉眼可見血色,應(yīng)離心取上清。
      ②羊水及嬰兒血清：同上,應(yīng)避免溶血.
      ③腦組織：腦組織尸檢、活檢標(biāo)本,加1mlPBS標(biāo)本緩沖液研磨后，待檢。
      ④眼及皮膚病灶分泌物：用預(yù)測（半干）棉拭子直接取患處分泌物，置1mlPBS標(biāo)本緩沖液中送檢。
      ⑤生殖器（宮頸、陰道、外陰、陰莖）標(biāo)本：先用消毒棉拭子擦去病變部位表面粘液、污垢，再用預(yù)潮棉拭子用力擦拭患處分泌物，置1mlPBS標(biāo)本緩沖液中送檢。
      （2）標(biāo)本處理
      ①預(yù)處理：所有液體標(biāo)本均可直接進(jìn)行模板制備;可以取100μl標(biāo)本液，離心5000r/min×5min后，去上清，取沉淀物進(jìn)行模板制備。
      ②模板制備：a：蛋白酶K消化裂解法：沉淀物加100μl蛋白酶K消化裂解液，55℃1h后，煮沸10min，離心5000r/min×5min，收集上清。b：水煮法：沉淀物加100μl蒸餾水，搖均水煮20min，離心5000r/min×5min收集上清。c：1%TritonX-100裂解法：取采集的標(biāo)本液100μl，加入1μlTritonX-100，水煮20min，5000r/min×5min，收集上清。d：5%NP-40裂解法：取采集的標(biāo)本液100μl，加5μlNP-40，水煮20min，5000r/min×5min收集上清。e：如標(biāo)本溶血嚴(yán)重經(jīng)上述裂解處理后，再加等體積酚-氯仿抽提、冷乙醇沉淀DNA，加10μlDW溶解待檢。
      2、PCR擴(kuò)增
      （1）引物設(shè)計(jì)。以HSVDNA聚合酶的高保守區(qū)為檢測靶序列以確保特異性。設(shè)計(jì)3個(gè)引物，一個(gè)上游共同性引物，DNAP5（5′ATGGTGAAAACATCGACATGTACGG3′）：二個(gè)下游特異性引物，DNAP3-1（5′CCTCGCGTTCGTCCTCGTCCTCC3′）和DNAP3-2（5′CCTCCTTGTCGAGGCCCCGAAAC3′），可以分別擴(kuò)增出HSV-1469bpDNA片段（1981～2359）、HSV-2391bp片段（1561～1953）：從二型PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中設(shè)計(jì)了一個(gè)不分型的特異性探針HSVP35GGCGTAGTAGGCGGGGATGTCGCG3）。
      （2）PCR實(shí)驗(yàn)體系。取模板10μl：DNAP50.5（0.2μmol/L）：DNAP3-10.5μl(0.2μmol/L)：DNAP3-20.5μl(0.2μmol/L)：4×dNTP8μl(4×200μmol/L)：10×dNTP8μl(4×200μmol/L);10×緩沖液10μl：DMSO4μl;加DW65.5μl;石蠟油30μl.。
      水煮（96℃～100℃）7min
      加TaqDNA聚合酶1μl;（2.5U）
      72℃4min
      ↓
      95℃40s
      ↓
      65℃60s→72℃70s
      ↓33個(gè)循環(huán)
      70℃4min
      3．?dāng)U增產(chǎn)物的檢測和分析
      （1）瓊脂糖凝膠電泳染色法：取擴(kuò)增產(chǎn)物20μl加樣品緩沖液4μl混勻后，點(diǎn)樣于2%瓊脂糖凝膠板，70V電泳15～20min，溴化乙錠（EB）染色5min，于紫外燈下觀察結(jié)果在溴酚藍(lán)后面有一條或二條亮紅帶為陽性結(jié)果，HSV-2帶在前，HSV-1帶在后，無帶則為陰性結(jié)果。
      （2）XhoI酶譜法：取HSV-1型PCR產(chǎn)物50μl加XhoI50U，37℃1h后，置3%瓊脂糖凝膠中，70V電泳15～20min，可產(chǎn)生46bp片段帶（引物后面）;與正常PCR產(chǎn)物比較，XhoI酶切后的大片段電泳位置前移。
      （3）Southern印跡法：PCR產(chǎn)物20μl經(jīng)電泳分離后，用變性液處理60min，再用中和液處理90min，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上：80℃烤膜2h，42℃預(yù)雜交（雜交液中）30min，加入32p標(biāo)記HSVP3探針后,42℃雜交過夜;次日用1%SDS/PBSpH7.2,42℃洗15min，0.5%SDS/PBSpH7.2,42℃洗15min;膜置X線暗盒內(nèi)放射性自顯影12～15h,顯影為陽性,不顯影為陰性。
      （二）套式PCR
      套式PCR（nestedprimers-polymerasechainreaction，NP-PCR）是通過“外側(cè)”、“內(nèi)側(cè)”兩對引物，即一對擴(kuò)增較大DNA片段的“外側(cè)”引物和一對位于擴(kuò)增產(chǎn)物中再擴(kuò)增小片段的“內(nèi)側(cè)”引物，這樣兩次連續(xù)放大可以提高PCR檢測的靈敏度，保證產(chǎn)物的特異性。但該方法不能分型，能100%檢出HSV-1，50%檢出HSV-2，應(yīng)改進(jìn)分型檢測HSV，更好地在臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究中推廣應(yīng)用。
      1、標(biāo)本處理：
      （1）標(biāo)本采集同上
      （2）DNA制備：①腦脊液：取100μlCSF水煮15min,加入250μl無水乙醇，放-30℃10min;離心10000g30min，去上清，30℃干燥后，加入10μlDW;②腦組織細(xì)胞：取沉淀物加100μl蛋白酶K消化裂解液，56℃作用1h，水煮10min;取上清加入等體積酚一氯仿（V/V），輕搖10min，離心10000r/min×10min;取水相，加入250μlDW溶解。
      2、PCR擴(kuò)增
      (1)引物設(shè)計(jì)：選擇HSV1糖蛋白D基因?yàn)闄z測靶基因。
      (2)PCR實(shí)驗(yàn)體系和程序：反應(yīng)體積為50μl;模板10μl;BJHSV1.10.5μl(0.2pmol/L);BJHSV1.20.5μl(0.2pmol/L);10×緩沖液5μl;4×dNTP4μl(4×200mmol/L);DW27μl;石蠟油30μl。循環(huán)參數(shù)為95℃30s;55℃30s;72℃60s;循環(huán)20次,取其擴(kuò)增產(chǎn)物1μl加入含有BJHSV1.3和BJHSV1.4反應(yīng)體系中進(jìn)行套式擴(kuò)增,先95℃變性2min，循環(huán)參數(shù)為95℃30s;55℃30s;72℃60s;循環(huán)30次后，72℃延伸5min;。
      (3)擴(kuò)增產(chǎn)物分析：
      ①瓊脂糖凝膠電泳染色法：
      取擴(kuò)增產(chǎn)物10μl點(diǎn)樣于2%瓊脂糖凝膠中，70V電泳15-20min,溴化乙錠染色5min，于紫外燈下觀察結(jié)果,在溴酚蘭后面有一條，或二條亮紅條帶為陽性結(jié)果,HSV-2帶在前，HSV-1帶在后，無帶則為陰性結(jié)果。
      ②Southern印跡法：
      PCR產(chǎn)物20μl經(jīng)電泳分離后，用變性液處理60min，再用中和液處理90min，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，80℃烤膜2h，42℃預(yù)雜交（雜交液中）30min，加入32P標(biāo)記HSV探針后，42℃雜交過夜，次日用1%SDS/PBSpH7。2，42℃洗15min，0.5%SDS/PBSpH7.2，42℃洗15min;膜置X線暗盒內(nèi)，放射性自顯影12-15h，，顯影為陽性，不顯影為陰性。
      （三）、聚合酶鏈反應(yīng)-酶譜法（polymerasechainreaction-endonucleasecleavagePCR-EC）
      具有經(jīng)濟(jì)廣泛等特點(diǎn);不僅能一次性分型檢測HSV-1，HSV-2，EBV，CMV四種病毒，而且方法本身快速、方便、無放射線損傷，易被實(shí)驗(yàn)室接受?？蓹z出3個(gè)CFU的HSV1，靈敏度高，能檢測出中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染第1dCSF中HSVDNA陽性結(jié)果，并可用于藥物治療效果的評價(jià)。由于病毒的變異性，會(huì)出現(xiàn)酶切點(diǎn)突變丟失現(xiàn)象，從而造成酶切陰性結(jié)果。對此可以通過型特異性探針或序列分析解決。
      1.標(biāo)本處理
      （1）標(biāo)本采集，方法同上。
      （2）DNA模板制備：每份標(biāo)本取200μl，按200μg/ml加入蛋白酶k，56℃作用1h;
      加入等體積的酚-氯仿（v/v）輕搖10min，離心1000r/min×5min;取水相加入500μl(2.5倍體積)無水乙醇，-20℃過夜沉淀DNA，離心15000r/min×5min,吸去液體，30℃干燥后,加蒸餾水25μl溶解,待檢。
      2.引物設(shè)計(jì)：
      P1，5′CGACTTTGCCAGCCTGTACC3′
      P2，5′AGTCCGTGTCCCCGTAGATG3′
      （1）PCR實(shí)驗(yàn)體系：
      反應(yīng)體積100μl;模板10μl;P10.5μl(10pmol/L)，P20.5μl(10pmol/L);4×dNTP4μl(4×200mmol/L);10×緩沖液10μl,DMSD5μl,DW65μl,循環(huán)參數(shù)為94℃60s;60℃60s;72℃60s;循環(huán)40次72℃延伸4min。
      （2）擴(kuò)增產(chǎn)物檢測與酶切分型.
      ①第一步電泳鑒定：取10μlPCR產(chǎn)物加4μl樣品緩沖液,加入2%瓊脂糖凝膠板,70V電泳(5-20min)加EB染色5min后,紫外燈下觀察,可初步鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物大小。
      ②酶切分析：分別取20μlPCR產(chǎn)物于2個(gè)Eppendf管中，加入50μl無水乙醇，-20℃沉淀DNA，再分別用20μlSmal和BamHI反應(yīng)緩沖液溶解，加入SmaI或BamHI50U于相應(yīng)Eppendf管內(nèi)，37℃作用1h。
      ③第二步電泳分型，取10μlPCR酶切物加4μl樣品緩沖液，加到2%瓊脂糖凝膠中,70V電泳,15-20min后,EB染色5min,與同步加入未酶切的PCR產(chǎn)物相對照。
      （四）用RT-PCR檢測單純皰疹病毒
      RNA的聚合酶鏈反應(yīng)（RNA-PCR），可能通過檢測HSV不同期的RNA，這不僅可診斷HSV感染，而且有利于HSV的潛伏期感染機(jī)制的深入研究。
      RT-PCR是以RNA為模板經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（RT）產(chǎn)生cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增以達(dá)到檢測目的。因此，RNA-PCR也可稱為RT-PCR。
      1、標(biāo)本處理：
      組織塊細(xì)胞總RNA提取，取100mg組織標(biāo)本，加1ml硫氰酸胍變性液，于勻漿器中，室溫研磨均勻后，移入2.5mlEppendf管中。依次加入0.1ml3mol/L(pH4.0)NaAc,1ml水飽和酚和0.2ml氯仿一異戊醇混勻,用力振搖10s,置冰浴15min。10000g4℃,離心20min,取上清水相(上層DNA、下層DNA和變性蛋白質(zhì))加入等體積異丙醇置-20℃1h,沉淀RNA。離心15000r/min×10min,棄上清,RNA重新用0.3ml硫氰酸胍變性液溶解,再加0.3ml異丙醇沉淀,-20℃1h,沉淀RNA.離心15000r/min×10min,去上清,沉淀RNA用75%冷乙醇洗一次,真空干燥。.加10μlTE緩沖液（pH7.4）溶解,低溫保存?zhèn)溆?臨用前冰浴溶解。
      2、PCR擴(kuò)增：
      （1）引物設(shè)計(jì)：選擇HSV-1ICPO基因(極早期)為檢測靶基因.設(shè)計(jì)2個(gè)引物，
      P15′GGATCCTCACGTGGTTACCCGCGGTCT3′
      P25′AAGCTTCCGGGGCCGTCCCCGCGGGCG3′可以擴(kuò)增ICPO中266bp序列。
      1個(gè)探針：5′CCGGCTGGAGCCGCCGCACCCTGCT3′。
      （2）PCR實(shí)驗(yàn)體系：總反應(yīng)體積為50μl，模板10μl（0.25-1.0μg）P11μl(20pmol/L);P21μl(20pmol/L);4×dNTP4μl（200μmol/L);10×緩沖液5μl;AMV(逆轉(zhuǎn)錄酶)2μl(50U);DW26μl;循環(huán)參數(shù),94℃變性2min后94℃50s，60℃60,72℃60s，循環(huán)40次后72℃延伸5min。
      3、擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定：
      （1）瓊脂糖凝膠電泳染色法：取10μlPCR擴(kuò)增產(chǎn)物加4μl樣品緩沖液，混勻后加樣2%瓊脂糖凝膠板，70V電泳15-20min，EB染色5min。紫外燈下觀察擴(kuò)增條帶。
      （2）Southern印跡雜交法：用32P標(biāo)記的特異性探針檢測PCR產(chǎn)物，方法同上。
      總之，在HSV感染性疾病的臨床診斷中，PCR能對前病毒或潛伏期低復(fù)制的HSV特異性靶DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增檢測，遠(yuǎn)較DNA探針敏感，并能在血清中抗體出現(xiàn)前就可以檢出。因此，PCR無論是作為基礎(chǔ)研究手段，還是作為臨床檢驗(yàn)診斷方法，均具有廣闊的前景。
      五、病理組織學(xué)診斷
      細(xì)胞內(nèi)水腫，基底層形成大水皰，病灶周圍有多核巨細(xì)胞浸潤，特別是多核白細(xì)胞與淋巴細(xì)胞充斥于病灶中間。